Sekvenování, které určuje pořadí nukleotidů („písmen“ – A, C, T, G) v molekule DNA, se stalo nedílnou součástí moderní biologie. Jeho metodika i využití jsou popsány v článku na str. LXXIII kuléru této Živy. Zde jsou zařazena schémata ukazující základní principy, na nichž stojí jak tradiční Sangerova metoda, při které sekvenujeme jedinou molekulu DNA, tak i dvě vybrané metody tzv. druhé generace – 454 a Illumina sekvenování, kdy dochází ke čtení milionů molekul DNA najednou.
Citovaná a použitá literatura
HEATHER, James M.; CHAIN, Benjamin. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 2016, 107.1: 1-8.
GOODWIN, Sara; MCPHERSON, John D.; MCCOMBIE, W. Richard. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics, 2016, 17.6: 333-351.
Webové adresy názorných animací detailně zobrazující sekvenční metody druhé generace
Illumina www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
454 www.youtube.com/watch?v=rsJoG-AulNE
IonTorrent www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs
Pacific Bioscience www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI
Nanopore www.youtube.com/watch?v=CE4dW64x3Ts
The principles of three selected methods (Sanger sequencing, 454, Illumina) are presented in schematic figures; the detailed information on approaches in sequencing of DNA molecules is provided in a separate paper of this issue, pp. LXXIII–LXXVI.
-
Sangerova metoda. Templátová DNA (A); DNA polymeráza přidává nukleotidy k rostoucímu řetězci DNA podle předlohy – templátu (B). Přidáním dideoxynukleotidu, který je označen fluorescenční značkou, dojde k zastavení syntézy nového řetězce DNA (C). Zahřátím se dva řetězce DNA oddělí (D) a proces syntézy nového řetězce polymerázou se může opakovat. Výsledné molekuly se seřadí podle velikosti a podle fluorescenčního značení se odvodí výsledná sekvence (E). Orig. M. Kolísko, některé části obrázku upraveny podle: J. M. Heather a B. Chain (2016)
-
Mezi metody druhé generace patří 454 sekvenování. DNA se naváže na mikrokuličku, na níž je posléze enzymatickou reakcí namnožena (A). Mikrokuličky se vloží do komůrek na sekvenační destičce (B). Vždy jeden typ nukleotidu je přidán do reakční směsi. Jestliže DNA polymeráza zařadí daný nukleotid do nového řetězce, dojde k uvolnění pyrofosfátu (PPI), který je převeden sulfurylázou na adenosintrifosfát (ATP). Luciferáza pak za použití ATP převede luciferin na oxyluciferin, přičemž dojde k vyzáření světla, které zachytíme kamerou (C). Orig. M. Kolísko, některé části obrázku upraveny podle: J. M. Heather a B. Chain (2016)
-
Další pokročilá metoda – Illumina. DNA je navázána na destičku a lokálně namnožena (A). Tím se vytvoří skupiny identických molekul, které jsou poté sekvenovány. DNA polymeráza přidá do rostoucího řetězce jeden modifikovaný nukleotid značený fluorescenčním barvivem, jenž zároveň reverzibilně blokuje navázání dalšího nukleotidu (B). Kamera pak zachytí fluorescenční signál pro každou skupinu DNA molekul na destičce. Fluorescenční označení a blokace jsou odbourány a může dojít k připojení dalšího nukleotidu (C). Orig. M. Kolísko, některé části obrázku upraveny podle: J. M. Heather a B. Chain (2016)
