ŽIVA

Fluorescence chlorofylu – fyzikální jev ve službách výzkumu fotosyntézy

Fluorescence chlorofylu umožňuje rychle, citlivě a nedestruktivně zkoumat účinnost fotosyntézy, a tím projevy stresu u rostlin. Text slouží i jako úvodní příručka pro zájemce o měření indukované fluorescence pulzně modulovaným fluorometrem. Přibližuje principy a praktické využití této metody, upozorňuje na možné chyby při měření a interpretaci, a představuje nejdůležitější fluorescenční parametry.

Doporučená literatura

MAXWELL, Kate; JOHNSON, Giles N. Chlorophyll fluorescence—a practical guide. Journal of experimental botany, 2000, 51.345: 659-668.

https://doi.org/10.1093/jexbot/51.345.659

MURCHIE, Erik H.; LAWSON, Tracy. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of experimental botany, 2013, 64.13: 3983-3998.

https://doi.org/10.1093/jxb/ert208

KALAJI, Hazem M., et al. Frequently asked questions about in vivo chlorophyll fluorescence: practical issues. Photosynthesis research, 2014, 122.2: 121-158.

https://doi.org/10.1007/s11120-014-0024-6

Chlorophyll fluorescence enables rapid, sensitive, and non-destructive assessment of photosynthetic efficiency and plant stress. This text serves as an introductory guide to measuring induced fluorescence by a pulse-modulated fluorometer, explaining principles, practical use, key parameters, possible errors in measurement and interpretation, and the most important fluorescence parameters.

Obrazové přílohy

• V lahvičce je velmi zředěný extrakt chlorofylu v acetonu (chlorofyl se dobře rozpouští v organických rozpouštědlech). Když na ni ve tmě posvítíme modrým světlem, chlorofyl i přes nízkou koncentraci téměř veškeré světlo absorbuje. Protože ale excitovaný elektron v izolované molekule chlorofylu nemá možnost energii předat dále, vyzáří se zpět v podobě červené autofluorescence s maximem emise při vlnové délce 685 nm. Foto T. Hájek
  
• Posvítíme-li modrým světlem na list, lze rovněž fluorescenci spatřit, ale protože je chlorofyl součástí biochemických struktur, významná část excitační energie se uplatní dříve, než dojde k emisi fluorescence, která je tak méně očividná (v kroužku), ovšem dobře měřitelná. Foto T. Hájek
  
• Schematizovaný záznam fluorescence typického měřicího protokolu. Černou barvou je zobrazena fluorescence vyvolaná slabým měřicím světlem (F0), modrá představuje fluorescenci při aktinickém světle a červená fluorescenci vyvolanou záblesky saturačního světla (blíže ve slovníku na konci článku). Měření začíná s temnostně aklimatizovaným listem (A) odečtením minimální (F0) a maximální fluorescence (Fm), z nichž můžeme spočítat variabilní fluorescenci Fv (Fm – F0) a základní fluorescenční poměr Fv/Fm (zde má hodnotu 0,80). Následuje zhášecí analýza, kdy po zapnutí aktinického světla fluorescence (F) prudce vzroste a obratem pomaleji klesá – zháší se (B) tím, jak se rozbíhá fotosyntéza i nefotochemické procesy a otevíráním průduchů. Zde došlo k ustálení fluorescence (Fs) i maximální fluorescence na světle (Fm′) po 8 minutách (C). Obvykle až z těchto ustálených parametrů počítáme hodnoty účinnosti fotosystému II (FS II) na světle a z Fm a Fm′ i velikost nefotochemického zhášení NPQ. Po zhasnutí aktinického světla můžeme v rámci relaxační analýzy sledovat, jak se postupně obnovuje maximální fluorescence Fm′′ (D) tím, jak se nejdříve deaktivují nefotochemické procesy (qE a qT) a případně i vratným poškozením FS II (fotoinhibicí, qI). V našem případě došlo k obnovení Fm až po čtyřech hodinách temnostní relaxace (E). Orig. T. Hájek
  
• Světelné křivky fluorescenčních parametrů (obr. a–c) a hrubého fotosyntetického příjmu CO2 (d) změřené u porostu rašeliníku bradavčitého (Sphagnum papillosum), který byl plně nasycen vodou. Se stoupající intenzitou ozářenosti klesá účinnost elektronového přenosu v FS II (ΔF/Fm′) s tím, jak se rozbíhají nefotochemické procesy (NPQ), neboť stále větší počet fotonů, které chlorofyl absorbuje, nelze využít (to lze zobrazit jako plochy mezi červenou šipkou a světelnou křivkou). Vynásobíme-li ΔF/Fm′ hodnotou ozářenosti (na ose x), dostáváme informaci o relativní rychlosti přenosu elektronů (b), která za určitých podmínek koreluje s rychlostí fotosyntézy (d). V našem případě se elektronový transport i fotosyntéza nasytí již při středních ozářenostech (černá šipka), což je dáno především nedostatkem CO2, protože voda v mechovém porostu značně zpomaluje rychlost jeho difuze k buňkám. Při vyšších ozářenostech však vidíme, že elektronový transport zrychluje. Je to tím, že se aktivuje alternativní spotřebič elektronů (zde asi kyslík v Mehlerově reakci, blíže v textu), čímž hodnota elektronového toku přestává být prediktorem rychlosti fotosyntézy. Už poměrně nízká počáteční strmost světelné křivky fotosyntézy (d), tedy hodnota její maximální kvantové účinnosti (α = 0,04, červená šipka) naznačuje nějaké trvalé snížení kapacity fotosyntézy právě na úrovni FS II, což potvrzuje snížená hodnota Fv/Fm oproti potenciálnímu maximu 0,83 (a). Je to pravděpodobně dáno trvalou přítomností určité míry NPQ, která je u mechů běžná – zvládnout stres je pro bezcévné rostliny důležitější než maximalizovat fotosyntézu. Orig. T. Hájek
  
• Pomocí zobrazovací fluorescence chlorofylu lze sledovat rozložení fotosyntézy v ploše. V našem případě v listech javoru klenu (Acer pseudoplatanus) odebraných za horkého slunečného odpoledne z osluněné a odvrácené strany stromu. Pro každý z tisíců obrazových bodů jsou spočteny parametry Fv/Fm, ΔF/Fm′ a NPQ a jejich hodnota zobrazena pomocí barevné škály. Rozložení Fv/Fm po 30minutovém zatemnění bylo v ploše slunného listu heterogenní a průměr 0,62 značí výrazné snížení vlivem fotoinhibice. Zato stinný list za stejnou dobu zatemnění dokázal Fv/Fm relaxovat v celé ploše až k teoretickému maximu 0,83. Rozložení ΔF/Fm′ a NPQ po pěti minutách při mírné ozářenosti aktinickým světlem odhalilo skrytou prostorovou heterogenitu. To ukazuje na rozdílnou citlivost obou parametrů vůči různým intenzitám stresu. Proč ale nemůžeme zobrazit NPQ pro slunný list? Protože pro výpočet NPQ potřebujeme znát plně relaxovanou hodnotu Fm, která není zatížena fotoinhibiční složkou nefotochemického zhášení qI (obr. 3). V tomto konkrétním případě byla relaxovaná hodnota Fv/Fm = 0,80 změřena až druhý den ráno a její Fm by tak mohlo být dodatečně použito k vyjádření NPQ. Orig. T. Hájek
  
• Výkonný přenosný fluorometr (vlevo vzadu) využívá svazku optických vláken, která přivádějí všechny typy světel na vzorek (zde vidíme červené aktinické světlo) a zároveň odvádějí vyzářenou fluo rescenci zpět k analyzátoru. Detailní průběh měření můžeme sledovat na počítači nebo tabletu. Držák (v popředí) zajišťuje neměnné umístění optické sondy vůči listu po celou dobu měření. Kapesní, méně výkonné fluorometry bez vláknové optiky se přikládají přímo na list. Foto T. Hájek
  
• Zobrazovací fluorometr umožňuje zobrazovat plošnou fluorescenci z celých rostlin nebo jejich částí (obr. 5). Lze jej účinně využít i k měření většího množství vzorků najednou, pro které se dají vyčíslit fluorescenční parametry samostatně. Mohou to být např. semenáčky při selekci mutací ve šlechtění, stélky mechů, suspenze řas anebo, tak jako zde, listové terčíky. Foto T. Hájek
  

Archiv článků pro pedagogy a studenty

© 2025 Časopis ŽIVA – Rozhled v oboru veškeré přírody.
Založil roku 1853 J. E. Purkyně.
Vydává Nakladatelství Academia,
Středisko společných činností AV ČR, v. v. i., za podpory Akademie věd ČR.