ŽIVA

Imunitní systém a jeho studium pomocí průtokové cytometrie

Všechny mnohobuněčné organismy vyvinuly pro ochranu před patogeny jednodušší nebo složitější soubory specializovaných tkání, buněk a molekul – imunitní systémy. Základními složkami jsou molekuly (humorální imunita) a buňky (buněčná imunita). Stamiliony let evoluční zkušenosti s bojem proti patogenům vedly k vývoji strategií, které byly postupně optimalizovány, a to i tím, že rychle mutující mikroorganismy daným strategiím unikaly nebo vyvíjely protistrategie. Celá naše evoluční historie je provázena eskalací závodu ve zbrojení mezi hosti­telem a patogeny a vítězné strategie jsou zaznamenány v genetické informaci. Miliony předků v rodové linii člověka nashromáždily a zapsaly do své genové informace množství molekulárních triků, jak se s patogeny vypořádat, a tyto triky se dále sčítaly a kombinovaly. Náš imunitní systém je tak souhrou evolučně prastarých obecných strategií, které sdílíme již s houbovci (fagocytóza), hmyzem (Toll-like receptory) a ostatními obratlovci (široké spektrum bílých krvinek a adaptivní imunita). Součástí evoluce byl postupný vznik buněčných specialistů pro konkrétní „bojové podmínky“ a konkrétní typy patogenů, kterých dnes u savců můžeme rozlišit jistě více než 100. Většina buněk imunitního systému není pevně vázána do 3D struktury tkání, je mobilní, lokalizovaná v krvi nebo z velké části do lymfatických orgánů. Proto je poměrně snadné je převést do buněčné suspenze, kterou lze po jednotlivých buňkách analyzovat pomocí průtokového cytometru (blíže o metodě na str. 21–24 této Živy). Typickým vzorkem pro průtokovou cytometrii jsou bílé krvinky, oddělené od červených krvinek centrifugací (nebo jsou červené krvinky lyzovány v hypotonickém prostředí). To je nezbytné proto, že červených krvinek je v krvi mnohem více než těch bílých, přibližně v poměru 500 : 1. Příklad využití průtokové cytometrie uvádíme v závěru článku.

Text vychází z přípravné brožury vytvořené pro 54. ročník Biologické olympiády – Nepřátel se nelekejte, na množství nehleďte aneb Obrana proti bližním (Balážová a kol. 2019).

K dalšímu čtení v Živě

Rozpoznávání – základ imunity I.–VI. (2010, 1–6)

Západ imunity v třetím věku (2021, 3)

Význam vrozené imunity u nových virových pandemií (2021, 6)

Kde se učí imunita (2022, 1)

Odkazy na pěkná ilustrační imunologická videa

Inner Life of the Cell – video zachycuje události buněčné fyziologie umožňující bílé krvince přesun z krevního řečiště do tkáně

https://youtu.be/wJyUtbn0O5Y?si=ntmoPI98CbuHzMwB

Neutrofilní granulocyt chemotakticky "lovící" a na závěr fagocytující patogenní bakterií

https://youtu.be/I_xh-bkiv_c?si=_Z62mUygB7vEwIuF

Makrofág fagocyticky likvidující bakteriální kolonii

https://youtu.be/iZYLeIJwe4w?si=MkLcjd4jYOv-7Yza

Cytotoxické T lymfocyty

https://youtu.be/ntk8XsxVDi0?si=vgcJ9EhdaO9iyBTS

Migrace neutrofilních granulocytů do místa poranění

https://youtu.be/_O91F_jqlNo?si=Yw8jmQAUeqFdxg4e

NK buňka (červená) v tkáni zabíjející nádorové buňky (změna barvy na modrou)

https://youtu.be/TTtQk-UIhf4?si=YUyPakTu7qC9axz1

Dendritická buňka (profesionální antigen-prezentující buňka) patrolující v tkáni, schopná se po aktivaci přemístit do mízní uzliny

https://youtu.be/rm1hMMvt0rk?si=UHZ-lQ9NpLU6urd6

Obrazové přílohy

• Hrudní dutina MHC II-EGFP knock-in myši, u níž byl gen kódující jeden z řetězců MHC II vyměněn za variantu s připojeným genem pro zelený fluorescenční protein (GFP). V této myši po osvícení modrým světlem zeleně fluoreskují makrofágy, dendritické buňky, B lymfocyty nebo epiteliální buňky brzlíku. Zde pod fluorescenční binolupou – intenzivně fluoreskujícím útvarem je brzlík, kde do­chází k pomyslné výchově T lymfocytů. Foto J. Černý a N. Malinská
  
• Krevní roztěr – neutrofilní granulocyty. Barveno Giemsou. Podrobněji v textu. Upraveno podle zdrojů z Wikimedia Commons
  
• Krevní roztěr – bazofilní granulocyty. Barveno Giemsou. Podrobněji v textu. Upraveno podle zdrojů z Wikimedia Commons
  
• Krevní roztěr – eozinofilní granulocyty. Barveno Giemsou. Podrobněji v textu. Upraveno podle zdrojů z Wikimedia Commons
  
• Tenké střevo MHC II-EGFP knock-in myši pod fluorescenční binolupou – je vidět Peyerův plát, množství tečkovitých útvarů (cryptopatches) a různě intenzivní signál stěny střeva podle množství antigen-prezentujících buněk v lamina propria (tenké vrstvě pojivové tkáně pod povrchem stěny střeva). Foto J. Černý a N. Malinská
  
• Makrofágy a kulovité dendritické buňky kultivované z myší kostní dřeně ve skenovacím elektronovém mikroskopu. Foto J. Černý a N. Malinská
  
• Oko MHC II-EGFP knock-in myši pod fluorescenční binolupou. Ve středu je duhovka – okolo ní jednotlivé Langerhansovy buňky a makrofágy lokalizované v rohovce. Langerhansovy buňky „patrolují“ a hlídají, zda do těla nepronikají patogenní organismy. Pokud zaznamenají nebezpečí, přesunou se do lymfatických orgánů a zde komunikují s T lymfocyty, které mohou aktivovat. Foto J. Černý a N. Malinská
  
• Analýza dat z průtokové cytometrie spočívá v tzv. gatování pozitivních nebo negativních signálů různých kombinací markerů. Nejprve si oddělíme populaci buněk od signálu menších událostí (obr. a) a vybereme si pouze buňky, které byly v proudu kapaliny samy – singlety (b). Nebudeme tak analyzovat kombinaci markerů dvou nebo více buněk jako jednu událost. Dále pomocí jaderného barvení vybereme pouze živou část buněk (c). Zde byl použit Hoechst, který se váže do žlábku DNA, ale neprostupuje membránou, do živých buněk se nedostane. Jako první si poté „zagatujeme“ populaci všech imunitních buněk – těch, které exprimují marker CD45 (d). Z nich můžeme rozlišit  T lymfocyty, NK buňky, NKT buňky (kombinují vlastnosti T lymfocytů a NK buněk, plní unikátní roli propojující vrozenou a adaptivní imunitu) a zbylou negativní populaci, a to pouze dvěma markery – CD3 (pro T lymfocyty) a NK1.1 (značí NK buňky; e). Z populace T lymfocytů jsme schopni rozeznat CD8+ cytotoxické  T lymfocyty a CD4+ pomocné T lymfocyty (f). Z pomocných T lymfocytů můžeme dále identifikovat CD25+ T lymfocyty, které by měly být z velké části regulačními  T lymfocyty (i). Z populace negativní na markery CD3 a NK1.1 dokážeme s využitím CD19 a MHC II určit populaci B lymfocytů (exprimují oba markery) a populaci ostatních antigen-prezentujících buněk (APC, exprimují pouze MHC II; g). Marker CD11b nám pak pomáhá rozpoznat další populace buněk (h). Z CD11b negativních buněk pomocí CD11c a MHC II určíme dendritické buňky (j), naopak z CD11b pozitivních pomocí F4/80 velkou část makrofágů (k). Použitím 11 protilátek s různými fluorofory a fluorescenčního jaderného barviva jsme tedy byli schopni určit až 9 buněčných populací vyskytujících se ve slezině. Z archivu katedry buněčné biologie PřF UK
  

Archiv článků pro pedagogy a studenty

© 2025 Časopis ŽIVA – Rozhled v oboru veškeré přírody.
Založil roku 1853 J. E. Purkyně.
Vydává Nakladatelství Academia,
Středisko společných činností AV ČR, v. v. i., za podpory Akademie věd ČR.