ŽIVA

Průtoková cytometrie – 50 let v biologickém výzkumu a klinické praxi

Průtoková cytometrie (Fluorescence-Activated Cell Sorting – FACS) je metoda první volby pro analýzu a třídění buněk nebo částic v kapalině na základě jejich fyzikálních a chemických vlastností. Používá lasery k excitaci fluoroforů (obvykle konjugovaných s protilátkami) pro specifickou identifikaci molekul na buňkách nebo uvnitř nich. Umožňuje rychlou analýzu velikosti buněk, granulity a jejich typických molekul v komplexních směsích, což je využitelné v celé řadě aplikací – zvláště v imunologii.

K dalšímu čtení v Živě

Rozpoznávání – základ imunity I.–VI. (2010, 1–6)

Západ imunity v třetím věku (2021, 3)

Význam vrozené imunity u nových virových pandemií (2021, 6)

Kde se učí imunita (2022, 1)

Flow cytometry, or Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS), is a first choice technique for analysing and sorting cells or particles in a fluid based on their physical and chemical properties. It uses lasers to excite fluorophores (typically conjugated to antibodies) used for the specific identification of molecules on or in cells. This allows for rapid analysis of cell size, granularity, and markers, aiding in research, diagnostics and particularly in immunology.

Odkazy na pěkná ilustrační imunologická videa

Inner Life of the Cell – video zachycuje události buněčné fyziologie umožňující bílé krvince přesun z krevního řečiště do tkáně

https://youtu.be/wJyUtbn0O5Y?si=ntmoPI98CbuHzMwB

Neutrofilní granulocyt chemotakticky "lovící" a na závěr fagocytující patogenní bakterií

https://youtu.be/I_xh-bkiv_c?si=_Z62mUygB7vEwIuF

Makrofág fagocyticky likvidující bakteriální kolonii

https://youtu.be/iZYLeIJwe4w?si=MkLcjd4jYOv-7Yza

Cytotoxické T lymfocyty

https://youtu.be/ntk8XsxVDi0?si=vgcJ9EhdaO9iyBTS

Migrace neutrofilních granulocytů do místa poranění

https://youtu.be/_O91F_jqlNo?si=Yw8jmQAUeqFdxg4e

NK buňka (červená) v tkáni zabíjející nádorové buňky (změna barvy na modrou)

https://youtu.be/TTtQk-UIhf4?si=YUyPakTu7qC9axz1

Dendritická buňka (profesionální antigen-prezentující buňka) patrolující v tkáni, schopná se po aktivaci přemístit do mízní uzliny

https://youtu.be/rm1hMMvt0rk?si=UHZ-lQ9NpLU6urd6

Obrazové přílohy

• Peyerovy pláty na tenkém střevě 12denního mláděte geneticky modifikovaného myšího kmene B6 s fluorescenčně značenou molekulou MHC II. Preparát v konfokálním mikroskopu v 3D. Zeleně antigen-prezentující buňky, exprimující molekuly MHC II. třídy, typicky dendritické buňky, makrofágy a B lymfocyty. Fixovaný preparát střeva byl dále značen protilátkami s přímo navázanými fluorofory (podobně jako u průtokové cytometrie), rozpoznávajícími CD4+ buňky (červeně, pomocné a regulační lymfocyty) a CD19+ (fialově, B lymfocyty). Jasně jsou vidět folikulární struktury složené převážně z plazmatických buněk – B lymfocytů exprimujících jen velmi malé množství MHC II. Foto N. Malinská
  
• Schéma průtokového cytometru. Blíže v textu. Upraveno podle: Matsusada Precision (www.matsusada.com). Kreslila R. Bošková
  
• Příklad analýzy cytometrického vzorku během Praktického cvičení z imunologie na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy. Mízní uzlina z geneticky modifikované myši (s molekulou MHC II spojenou se zeleným fluorescenčním proteinem GFP) byla převedena do buněčné suspenze a inkubována fluorescenčním barvivem Hoechst33258, s protilátkami CD3 (typická molekula T lymfocytů) a B220 (varianta molekuly CD45 typická pro B lymfocyty) s kovalentně navázanými fluorofory PE (phycoerythrin) a APC (allophycocyanin), které je spolu s GFP možné od sebe dobře fluorescenčně oddělit. Některé buňky v suspenzi jsou pozitivní pro GFP (ty, které syntetizují MHC II, jde o antigen-prezentující buňky), některé nesou navázanou protilátku rozpoznávající CD3, jiné protilátku rozpoznávající B220. Buněčná suspenze tak obsahuje čtyři fluorescenční látky – protein GFP, Hoechst33258, PE a APC. Celkem byly nasbírány signály z 10 tisíc buněk. A – pomocí bočního a přímého rozptylu (side a forward scatteru, SSC-A a FSC-A) je analyzována velikost a granularita bu­něk. Je zvolen region (červeně), v kterém se typicky nacházejí buněčné události. B – dále jsou fialovým regionem identifikovány události obsahující jednu jedinou buňku (singlety) z buněčných událostí. C – Hoechst33258 neproniká do živých buněk, pozitivita na ose y identifikuje během experimentu poškozené buňky nebo buňky apoptotické, které jsou z další analýzy odstraněny pomocí modrého regionu (obsahujícího živé buňky). V grafech D, E a F jsou tedy analyzovány pouze živé jednotlivé buňky. D – vynesení pozitivity protilátky rozpoznávající B220 (osa y) proti MHC II-GFP. Region P1 označuje populaci B lymfocytů (fialově, B220+, MHC II+). E – vynesení pozitivity protilátky proti CD3 (osa y) proti MHC II-GFP. Region P2 označuje T lymfocyty (hnědě, CD3+, MHC II–). F – vynesení pozitivity protilátky rozpoznávající B220 (osa y) proti pozitivitě protilátky proti CD3 (osa x). V jednotlivých kvadrantech jsou identifikovány a kvantifikovány tři hlavní buněčné populace v mízních uzlinách: UL – B lymfocyty (20,76 %), LR –  T lymfocyty (62,45 %) a LL – populace dvojitě negativních bílých krvinek (např. NK buněk, 15,93 %). Z archivu katedry buněčné biologie PřF UK
  
• Příklad analýzy cytometrických dat. Pomocí forward a side scatteru jsou identifikovány lymfocyty (malé leukocyty bez granulí), ty jsou vybrány a dále analyzovány na základě pozitivity pro znaky CD3 (součást T receptorového signalizačního komplexu) a CD19 (typického znaku B lymfocytů). Upraveno podle: Rapid Novor (www.rapidnovor.com). Kreslila R. Bošková
  
• Příklady fluoroforů, které je možné vázat na monoklonální protilátky a navzájem kombinovat při vícebarevné cytometrické analýze. Upraveno podle: FluoroFinder (https://fluorofinder.com). Kreslila R. Bošková
  
• Princip studia buněčného dělení (proliferace) průtokovou cytometrií. Upraveno podle: ABP Biosciences (www.abpbio.com). Kreslila R. Bošková
  
• Ukázka multiparametrické analýzy dat umožňující rozlišení 40 různých buněčných typů. Orig. O. T. Butron (www.colibri-cytometry.com)
  
• Příklad jednoho z nejpokročilejších současných cytometrů – BD FACSDiscoverTM S8 Cell Sorter – umožňujících sortování buněčných populací založené na spektrální a obrazové analýze jednotlivých buněk. Vrchol 50 let vývoje průtokových cytometrů. Zdroj: BD Biosciences
  

Archiv článků pro pedagogy a studenty

© 2025 Časopis ŽIVA – Rozhled v oboru veškeré přírody.
Založil roku 1853 J. E. Purkyně.
Vydává Nakladatelství Academia,
Středisko společných činností AV ČR, v. v. i., za podpory Akademie věd ČR.